FTMC vystoma moderni netiesinė mikroskopija ir DI – naujos galimybės biomedicinai ir skydliaukės vėžio diagnostikai

Straipsnio autorius – dr. Danielis Rutkauskas (FTMC Molekulinių darinių fizikos skyrius)

Lietuvos ir Rumunijos mokslininkų komanda užbaigė Lietuvoje trejus metus vykdytą netiesinės mikroskopijos projektą. Jo tikslas – atverti naujas skydliaukės vėžio diagnostikos galimybes, siekiant greičiau ir tiksliau įvertinti naviko pažeistus audinius, taikyti efektyvesnį ir labiau tausojantį gydymą.

Vis didesnį pagreitį įgauna ir dirbtinio intelekto (DI) naudojimas. Šio darbo rezultatas – Vilniuje įsikūrusio Fizinių ir technologijos mokslų centro (FTMC) Molekulinių darinių fizikos skyriuje sukurtas originalus plataus lauko netiesinis mikroskopas, kurio galimybės buvo išbandomos skydliaukės vėžio diagnostikai kartu su Bukarešto politechnikos universiteto mokslininkais.

Pirmieji atlikti bandymai davė džiuginančių rezultatų – todėl kviečiu pažvelgti giliau į šią technologinę naujovę, kurią su skyriaus kolegomis dr. Lena Golubewa ir dr. Yaraslau Padrez‘u vystome Biofizikinių tyrimų laboratorijoje.

Netiesiniai reiškiniai – gamtoje nesutinkama neįprasta šviesos dozė

Norint aiškiau suprasti, kaip veikia netiesinis mikroskopas, pirmiausia turime išsiaiškinti, ką reiškia netiesinės šviesos ir medžiagos sąveika.

Įprastai šviesa su medžiaga sąveikauja „tiesiškai“ – viena šviesos dalelė (fotonas) sužadina medžiagos atomą ar molekulę. Tai įprastas reiškinys gamtoje: pavyzdžiui, pavieniai Saulės šviesos fotonai pataiko į mūsų odos molekules, ir dėl to oda paruduoja.

O tam, kad atsirastų šviesos ir medžiagos sąveika, reikalingas labai intensyvus šviesos šaltinis – lazeris. Ir kuomet tokia šviesa susiduria su kokia nors medžiaga, pastarosios atomas ar molekulė sąveikauja jau ne su vienu, bet su keliais šviesos fotonais tuo pačiu metu. Kitaip sakant, vietoje vieno „svečio“ atvyksta keli – ir medžiaga gauna dvigubą, trigubą ar keturgubą šviesos dozę.

Tokios sąveikos galimybė buvo teoriškai numatyta dar XX a. pirmoje pusėje, tačiau eksperimentiškai šio reiškinio egzistavimas buvo patvirtintas tik keliais dešimtmečiais vėliau, atsiradus didelio intensyvumo lazeriniams šviesos šaltiniams.

Yra įmanomi įvairūs netiesinės sąveikos scenarijai. Keli šviesos fotonai gali būti medžiagos sugeriami, o ji šią energiją vėliau išspinduliuoja kaip švytėjimą (fluorescenciją), kurį galime pamatyti mikroskopu. Kita vertus, medžiaga gali sujungti kelis ją pasiekusius lazerio fotonus į vieną fotoną, turintį didesnę energiją. Taip susidaro nauja šviesa, kurios spalva būna kelis kartus „aukštesnio tono“ nei į ją siunčiama lazerio šviesa — šis reiškinys vadinamas šviesos harmonikų generacija.

Dar efektyviau tokie netiesiniai reiškiniai vyksta naudojant itin trumpų, femtosekundinių, impulsų lazerius. Kad įsivaizduotume, ką tai reiškia: mūsų akis mirkteli per maždaug 0,1 sekundės. O štai femtosekundė yra 100 trilijoną kartų trumpesnė. Tad nenuostabu, kad ir netiesinė mikroskopija pasaulyje pradėta intensyviau vystyti tik apie 1990-uosius, kai buvo sukurti ir tapo prieinami femtosekundiniai lazeriai.

(Dr. Yaraslau Padrez, dr. Danielis Rutkauskas ir dr. Lena Golubewa. FTMC nuotr.)

Metodas, leidžiantis sutaupyti brangaus laiko

FTMC ir Bukarešto politechnikos universiteto tyrimai susiję su histopatologija – mikroskopiniu audinių tyrimu siekiant nustatyti ligas, dažniausiai vėžį. Laikydamiesi jau ilgą laiką egzistuojančio vadinamojo „auksinio“ histopatologijos standarto, gydytojai patologai tokius bandinius ruošia keliais sudėtingais etapais: juos užpildo parafinu (ir šitaip sustingdo), veikia agresyviais tirpikliais, supjausto kelių mikrometrų storio sluoksniais ir nudažo specifiniais dažais. O jie reikalingi tam, kad išryškintų įvairias ląstelines struktūras, tokias kaip ląstelių branduoliai ar citoplazma. Šitaip paruošti bandiniai tuomet yra stebimi mikroskopu.

Visa ši procedūra trunka gana ilgai ir nėra ideali, pavyzdžiui, ji nesuteikia diagnostinės informacijos iškart, realiu laiku. Todėl mūsų mokslininkų komanda siūlo sprendimą – jau aptartą netiesinę mikroskopiją pasitelkiant femtosekundinį lazerį.

Mūsų metodas leidžia sutaupyti brangaus laiko, nes paruošti bandinius tampa paprasčiau: dėka to, kad audinyje yra medžiagų, kurios pasižymi netiesine sąveika su šviesa ir geba generuoti vienokį ar kitokį signalą, bandinių nereikia papildomai apdoroti dažais. O tai nepaprastai svarbu galvojant apie būdus pagreitinti medicininę diagnostiką.

Su kolegomis tyrėme skydliaukės vėžio bandinius (apie tai tuoj papasakosime išsamiau), ir skirtumas nuo tradicinio metodo buvo akivaizdus: jei įprastai toks tyrimas užtrunka iki kelių dienų, FTMC komanda atlikti matavimą (priklausomai nuo bandinio dydžio) gali per daug trumpesnį laiką: nuo kelių iki kelių dešimčių minučių.  

Netiesinė mikroskopija turi dar keletą privalumų: ji leidžia audinius apšviesti gan didelio bangos ilgio infraraudonąja šviesa, kuri juos mažiau pažeidžia ir geriau prasiskverbia į gilesnius sluoksnius. Dėl to galima matyti audinių struktūras ten, kur įprasti metodai jau praranda raišką.

Be to, ši technologija geba tiksliai „skenuoti“ audinį sluoksnis po sluoksnio jo visai nepjaustydama. Visa tai leidžia greitai gauti trimačius, nepažeisto audinio vaizdus, todėl netiesinė mikroskopija tampa patrauklia alternatyva tradiciniams biomedicininio vaizdinimo metodams.

(Dr. Danielis Rutkauskas. Hernandez & Sorokina / FTMC nuotr.)

Lazeris, kuris padeda įvertinti skydliaukės būklę

Visi išvardyti netiesinės mikroskopijos privalumai – daug žadantys vėžio diagnostikoje. Todėl, norėdami tai išbandyti ir vykdydami mokslinį projektą, su kolegomis įdiegėme pažangų plataus lauko antros harmonikos generacijos (AHG) mikroskopą biomedicininių bandinių vaizdinimui ir išbandė jo galimybes konkrečiai skydliaukės vėžio tyrimui.

AHG vyksta, kuomet dviem lazerio apšvietimo fotonams sąveikaujant su netiesinėmis savybėmis pasižyminčia medžiaga atsiranda vienas fotonas, kurio energija yra dvigubai didesnė nei pradinių fotonų. Taigi, naudojant, pvz., infraraudoną lazerį apšvietimui, AHG signalas gali būti žalios spalvos.

Biologiniuose bandiniuose stipriausia AHG pasižymi kolagenas – jungiamojo audinio baltymas (pav. 1a). Taigi ir tyrinėdami skydliaukės auglius mokslininkai vaizdino (gavo vaizdus mikroskopu) kolageno skaidulų tinklą auglio aplinkoje.

Kuo šis tyrimas svarbus? Kai skydliaukėje atsiranda svetimkūnis, nuo jo bandydamas apsisaugoti organizmas susidarantį auglį dažniausiai apaugina kolageno kapsule. Ji veikia kaip barjeras, stabdantis auglio plitimą į aplinkinius audinius. Pasirodo, tokios kapsulės kolageno skaidulų struktūra priklauso nuo auglio pobūdžio – o taip pat evoliucionuoja augliui augant ir aktyviai sąveikaujant su jį ribojančiu apsauginiu barjeru (pav. 1b, c).

Todėl tai, kaip atrodo kolageno skaidulos, gali būti naudojama kaip žymuo diagnozuojant vėžį. Jeigu gydytojai mato, kad kolageno kapsulė nepažeista (pav. 1b), vadinasi, navikas yra nepavojingas. O jei kapsulė pakitusi ar praardyta – jau turime reikalų su piktybiniu naviku (pav. 1c).

(Pav. 1. (a) Pavienis piktybinio skydliaukės naviko kolageno kapsulės AHG vaizdas. (b) Viso gerybinio naviko kapsulės AHG vaizdas. (c) Viso piktybinio naviko kapsulės AHG vaizdas)

Mūsų naudota plataus lauko netiesinės mikroskopijos technologija leido žymiai didesnę vaizdinimo išeigą nei tradiciškai naudojamų skenuojančių mikroskopų, kur objektyvo sufokusuotas lazerio spindulys vedžiojamas po bandinį, ir norimas vaizdas atkuriamas pagal tai, koks stiprus yra gautas signalas ir kur tiksliai jis buvo sukeltas bandinyje. Plataus lauko vaizdinimas yra naujesnė, didesnio našumo modifikacija, kur lazerinis apšvietimas išnaudojamas geriau, dengiant palyginti didelį bandinio plotą ir netiesinio signalo vaizdą registruojant greičiau.

Be to, procesą pavyko dar labiau paspartinti išmaniai derinant dviejų rūšių vaizdus: pirmiausia greitai sukuriamas mažos raiškos bendras vaizdas, padedantis nustatyti diagnostikai aktualiausias bandinio sritis, o tada tik tos svarbiausios vietos tiriamos didelės raiškos metodu. Taip gerokai sutrumpėja visa tyrimo procedūra.

Neuroninių tinklų panaudojimo galimybės

Pamatyti yra viena, tačiau interpretuoti vaizdus – visai kas kita. Kai kuriais atvejais kolageno skaidulų kryptis, aiškiai matoma AHG vaizde (pav. 1a), gali parodyti, kokioje stadijoje yra vėžinis auglys ir ar jis linkęs plisti. Tačiau ši paprasta taisyklė galioja toli gražu ne visada. Kaip įvertinti, ar gautas atvaizdas gali būti laikomas piktybinio naviko atvaizdu? Tam reikia palyginti didžiulį kiekį vaizdų, o tai padėti gali tinkamai „apmokyti“ neuroniniai tinklai – kurie yra dirbtinio intelekto (DI) dalis.

AHG vaizdams analizuoti naudojome negilų neuroninį tinklą. Rezultatai parodė, jog remiantis kolageno skaidulų morfologija sklydliaukės piktybinių ir gėrybinių auglių AHG vaizdus pavyksta teisingai klasifikuoti didesniu nei 90 proc. tikslumu. Tai taip pat reiškia, jog naudojant mūsų vaizdinimo ir duomenų analizės technologiją galime atskirti piktybinius skydliaukės auglius nuo gerybinių tokiu pat tikslumu.

Rezultatai džiuginantys, tačiau mokslinis darbas šioje srityje dar nėra baigtas. Šiuo metu svarstome, kaip dar labiau padidinti AHG mikroskopijos suteikiamą diagnostinį tikslumą pasitelkiant ir kitus netiesinius šviesos efektus.

Pavyzdžiui, naudojant dvifotonės sugerties fluorescencijos vaizdus (tai metodas, kai ląstelės sužadinamos vienu metu sugerdamos du silpnesnius infraraudonos šviesos fotonus) būtų galima gauti papildomos informacijos apie pačias naviko ląsteles. Tokie nauji duomenys suteiktų daugiau požymių neuroniniam tinklui ir tikėtina, kad pagerintų jo gebėjimą klasifikuoti auglio tipus. Taigi, ateityje planuojame toliau plėsti netiesinio mikroskopo galimybes ir gerinti galimybes realiam jo panaudojimui biomedicininei diagnostikai.

Tyrimas remiamas pagal 2023–2026 m. Lietuvos mokslo tarybos projektą „Plataus lauko antros harmonikos generacijos mikroskopija su dirbtiniu intelektu skydliaukės vėžio detekcijai“ (Nr. P-MIP-23-237).